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关于离子色谱的洗脱方法及实验流程

时间: 2019-05-10 04:09 浏览次数: 来源:赛默飞世尔液质联用

在这样经济迅速的发展环境里,生活各方面的增长,离子色谱实际上是高效液相色谱的一种,那么大家知道离子色谱的洗脱的方式有哪些吗?实验的步骤又有哪些呢?希望能给大家带来有用的帮助。下面我们就“关于离子色谱的洗脱方法及实验流程”来详细了解下。



【离子色谱的三种洗脱方式】


离子交换色谱洗脱方式有三种:



一是改变缓冲液pH,使蛋白质从吸附状态变为解吸附状态。如在阴离子交换色谱中,通过降低流动相pH使吸附在柱子上的带负电荷的蛋白质带正电,从而达到解吸附,在阳离子交换色谱中则是通过升高流动相pH的方法达到解吸附;


二是增加缓冲液的离子强度,将吸附强的分子从离子交换剂上替换下来;


三是缓冲液pH和离子强度同时改变。无论哪一种方法,都可用阶段洗脱和梯度洗脱两种方式进行。


阶段洗脱是用几个不同pH缓冲液或几个不同盐浓度的缓冲液逐步进行洗脱。即pH和离子强度变化不连续。而在梯度洗脱中,缓冲液的洗脱能力是连续增加的,由于后者分辨率更好,因此被广泛采用。


在经典色谱中需用梯度混合器来制造线性梯度,梯度混合器是由两个容器构成,两个容器安放在同一个水平上,一个盛起始缓冲液,另一个盛含较高离子强度或不同pH的缓冲液。二者用管子相连,以保持溶液的流体静力平衡。


当缓冲液从个容器流入柱内,第二个容器的缓冲液进入个容器自动补足,使缓冲液形成梯度。


现在许多中低压色谱仪器(如Waters,Pharmacia等公司的一些产品)和高效液相色谱一样可以用计算机控制双泵自动配制流动相,很容易地获得直线或非直线、连续或非连续的梯度模式,以满足不同的分离需要。


通常对线性梯度的要求是:


(1)洗脱液的总体积应足够大,一般梯度至少要四倍床体积,使分离的各个峰有较好的分辨率;


(2)梯度上限要有足够强的洗脱能力,使吸附的紧密的物质也能够从柱子上被洗脱下来;


(3)梯度的斜率不应太大,以确保各峰能够分开,但又不应太小,以免峰形过宽甚至形成拖尾;一般认为,梯度体积越大,梯度变化越缓,则分辨率越好。


实验操作


1.填料的预处理


2.装柱


离子交换色谱不同于凝胶色谱,柱子通常较为短小,对于一般工作,通常选长度为10-40cm的柱已足够。柱的直径按照欲分物质的数量来选定。对于很复杂的混合物和进行精细分析是用细长的柱,分辨率较好;对于初步分离可用较粗、容量较大的柱。装好的柱子用起始缓冲液充分平衡后上样。


3.上样


离子交换色谱柱必须充分平衡后方可上样。上样量取决于色谱柱的交换容量,一般为交换容量的70-80%,上样体积可以不受限制。通常低浓度样品上样可达床体积的几倍到几百倍。这一点对较稀的样品极为有利,可以同时起到分离和浓缩的双重作用,可谓一举两得。


但用于分析时,为了提高分辨率,上样量体积适当减小。用于离子交换色谱分离的样品溶液的离子强度和pH值必须与起始缓冲液(即流动相A液)一致,如不一致,应进行缓冲液转换,可通过透析或凝胶色谱来完成。


4.洗脱、样品收集


加样后用足够量的起始缓冲液洗涤除去不吸附的物质,然后再进行洗脱。洗脱可选择不同的方法,用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的样品组分经紫外检测器实时检测(检测波长一般为280nm),用分部收集器或手工收集。


5.再生


样品洗脱完毕后要进行再生,以除去仍然结合在柱子上未完全洗下的一些蛋白质,通常用流动相B液再洗脱1个柱体积即可。


6.平衡


再生后的柱子欲再次进样需重新进行平衡,平衡一般用A液(即0%B液)洗涤柱子至少四个柱体积。


7.保存


柱子不用时应用强洗脱剂洗去结合于柱子上的杂质,然后再用蒸馏水彻底清洗后加抑菌剂保存。


【离子色谱的实验步骤】


一、实验目的


通过非离子聚丙烯酰胺的凝胶渗透色谱分级实验,掌握非离子聚丙烯酰胺的凝胶渗透色谱分级方法。



二、实验步骤


在烧杯中将10g色谱用硅胶用400ml水溶胀两天。在一根2m长的柱子(直径1.5~2cm)的出塞上面,放一层玻璃棉和几个玻璃珠。将柱子部分充水,把溶胀的硅胶小心地悬浮于其中,避免包藏空气泡。凝胶粒子沉下去,抽去上层的水。然后用蒸馏水洗涤凝胶,直至洗涤水加之甲醇中时不再发生浑浊。抽去上层水,使液面仅高出凝胶填料几毫米。


将250mg非离子聚丙烯酰胺在25ml蒸馏水中的溶液加到柱子中,打开出塞,用量筒按10ml级分收集流下的液体。在所给条件下一个级分的淋洗时间约为1h。当非离子聚丙烯酰胺溶液的液面下降到凝胶填料时,向柱中加蒸馏水作为淋洗剂。


把收到的每个级分都在搅拌下加到100ml含2滴盐酸的甲醇中。大约从第6个到第20个级分出现浑浊或沉淀,把沉出德聚合物级分滤出,用甲醇洗,在20℃下真空干燥至恒种。在25℃下用毛细管黏度计(直径0.35min)在水中测每个级分的黏度,从特性黏数计算各级分的分子量。聚合物量过少、不足以测定黏度的相邻级分可以合并起来。


将各个聚合物级分的量对淋洗时间作图。试把所有级分的总量和起始聚合物量进行比较,考察分级时聚合物是否有损失。损失不应超过3%。绘出积分和微分质量分布曲线即可。


以上关于“离子色谱的三种洗脱方式”和“离子色谱的实验步骤”的介绍,希望能让您了解“关于离子色谱的洗脱方法及实验流程”带来帮助。

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